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环球体育_不可不知的细胞检测方法——MTT
本文摘要:MTT基本原理  MTT全称之为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,中文有机化学起名叫3-(4,5-mtt二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:mtt噻唑蓝。

MTT基本原理  MTT全称之为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,中文有机化学起名叫3-(4,5-mtt二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:mtt噻唑蓝。是一种朱色调的染剂。

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  MTT酶活性测定,是一种检验细胞生存和生长发育的方式。其检验基本原理为活细胞膜蛋白中的琥珀酸脱氢酶能使外源MTT复原变成水不可溶的紫蓝色结晶体甲瓒(Formazan)并堆积在细胞中,而杀细胞不存在作用。二甲基亚砜(DMSO)能沉定细胞中的甲瓒,用酶益航人体免疫系统检查仪在490nm光波长处精确测量其吸光值,可间接性反映活细胞总数。

在一定细胞数范畴内,MTT结晶体组成的量与细胞数正相关。该方式已广泛作为一些微生物活性因子的特异性检验、规模性的抗癌药物检测、细胞毒副作用实验及其恶性肿瘤射线敏感度精确测量等。它的特性是敏感度低、经济发展。  缺陷:因为MTT经转变成所造成的甲瓒物质不溶液水,需要被沉定后才可以检验。

这不但使劳动量降低,也不会对试验結果的精确性造成危害,并且沉定甲的溶剂对实验者也是有损害。  MTT水溶液的提炼出方式  一般来说,此方法中的MTT浓度值为5mg/ml。因而,能够称量MTT0.5克,溶液100ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚白的培养液中,用0.22m滤纸过滤装置以去除水溶液里的病菌,敲4℃避光存留才可。在提炼出和存留的全过程中,器皿最烂用锡箔纸撕掉。

试验的情况下我一般再开超净工作台上的日光灯管来避光,确实那样比较好。  务必注意的是,MTT法不可以用于检验细胞相对数和较为魅力,但没法精确测量细胞绝对数。再用酶标仪检验結果的情况下,为了更好地保证 试验結果的线形,MTT吸入亮度最烂在0-0.7范畴内。

  MTT一般最烂在用现配,过滤装置后4oC避光存留两个星期内合理地,或提炼出成5mg/ml存留在-20度长时间存留,避免 反复冻融循环,最烂剂量装填,用避光袋或者黑纸、锡纸撕掉避光以防转化成。我一般都把MTT粉装填在EP菅理,用的情况下现配,必需往培育板里加,沒有适度一下子加上那么多,特别是在当MTT变为浅绿色时就意味著没法再用了。  MTT有致癌物质,用的情况下小心,有标准最烂携带那类透明色的簿膜胶手套.配置的MTT务必无菌检测,MTT对菌很敏感;往96孔板加时赛不避光也没事儿,确是時间较短,或是你没舒心的情况下能够把作业者台子上的照明灯具启动.  提炼出MTT时要PBS(ph=7.4)沉定。PBS秘方:Nacl8g Kcl0.3g Na2HPO41.44g KH2PO40.24g调pH7.4,定容1L。

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  一般MTT法实验步骤:  1:预苗细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配置单独细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞预苗到96孔板,每孔容积200ul.  2:培育细胞:同一般培育标准,培育3-5天(可依据实验目地和回绝规定培育時间)。  3:呈色:培育3-5天后,每孔加MTT水溶液(5mg/ml用PBS提炼出,pH=7.4)20ul.以后孵育4h,  中断培育,小心吸弃孔内培育上清液,针对飘浮细胞务必抽滤后再作吸弃孔内培育上清液。

每孔加150ulDMSO,起伏10min,使结晶体物充份溶化。  4:比色计:随意选择490nm光波长,在酶益航人体免疫系统监测仪器上精确测量各孔吸光值,纪录結果,以時间为横坐标轴,吸光度数值纵坐标绘图细胞生长曲线。  药品MTT法实验步骤  贴壁细胞:  1:收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度值,每孔重新加入100ul,铺板使待测细胞徵相对密度1000-10000孔,(边沿孔用无菌检测PBS铺满)。

  2:5%CO2,37℃孵育,至细胞单面铺满孔底(96孔厚底板),重新加入浓度梯度的药品,应以,细胞贴壁后才可特药,或两小时,或大半天時间,但大家常常在前一天中午铺板,隔日早上投药.一般5-七个梯度方向,每孔100ul,设3-五个复孔.提议设五个,不然没法反映具体情况  3:5%CO2,37℃孵育16-两天,条形显微镜下认真观察。  4:每孔重新加入20ulMTT水溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),以后培育4h。

若药品与MTT必须反映,可再作抽滤后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再作重新加入含MTT的培养液。  5:中断培育,小心吸掉孔内培养液。

  6:每孔重新加入150ul二甲基亚砜,置摇床边短路线起伏10min,使结晶体物充份沉定。在酶益航人体免疫系统检查仪OD490nm一处精确测量各孔的吸光度值。  7:另外设定徵零孔(培养液、MTT、二甲基亚砜),对比孔(细胞、完全一致浓度值的药品沉定物质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。


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